Khảo sát thành phần hóa học cao n-hexane của địa y Usnea aciculifera (Parmeliaceae)

Địa y và các hợp chất chuyển hóa thứ cấp của địa y có nhiều vai trò trong dược phẩm, chủ yếu bao gồm các chất kháng khuẩn, chất chống oxy hóa, kháng vi rút, chống ung thư, chống độc, chống viêm, giảm đau và hạ sốt. Usnea là một chi chủ yếu là dạng địa y fruticose có màu xanh xám nhạt phát triển giống như cây bụi không lá hoặc tua neo trên vỏ hoặc cành cây. Cao n-hexane của địa y Usnea aciculifera được khảo sát thành phần hóa học bằng cách áp dụng các kỹ thuật sắc kí dùng trong chiết tách, phân lập hợp chất thiên nhiên thu được bốn hợp chất tinh sạch. Tiến hành xác định cấu trúc hóa học bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và khối phổ (MS) cũng như so sánh với tài liệu tham khảo bốn hợp chất được đề nghị là Hexadecanoic acid (hay palmitic acid) (1), Diffractaic acid (2), Usnic acid (3) và Ergosterol-5á,8á-peroxide (4).

Từ khóa: Địa y, Usnea aciculifera, phenolic, steroid.

Giới thiệu

Trên thế giới có khoảng hơn 30000 loài địa y đã được biết đến. Địa y tăng trưởng với một tốc độ rất chậm, địa y dạng khảm tăng trưởng từ 0.1 - 10 mm/năm, địa y dạng lá tăng trưởng từ 2 - 4 cm/năm. Địa y dễ bị tổn hại do chất ô nhiễm có trong không khí và có thể được xem là chỉ thị về chất lượng không khí[1]. Hiện nay, địa y được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu, nhiều hợp chất mới có hoạt tính hấp dẫn được phát hiện. Trên thế giới, trong 52 chi địa y được dùng làm thuốc thì chi Usnea được sử dụng rộng rãi [1]. Chi Usnea được nhắc đến và được phát triển ở các khu rừng phương bắc, nhưng tính đa dạng loài cao nhất của nó là ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Chi Usnea được đặt tên bởi Dillenius (1742) và cho đến nay đã có khoảng 350 loài được tìm thấy thuộc chi Usnea.[2] Địa y Usnea từ xưa được dùng làm nguyên liệu cho thuốc nhuộm, mỹ phẩm, chất bảo quản và khử mùi, và đặc biệt dùng làm thảo dược ở Trung Quốc, Nhật Bản, châu Á, châu Phi và châu Âu để giảm đau, kháng viêm và hạ sốt.[3-8] Ở Việt Nam, người ta dễ dàng tìm thấy sự có mặt của địa y ở những nơi quen thuộc với sự phân bố phong phú và đa dạng. Báo cáo này trình bày khảo sát thành phần hóa học của cao n-hexane của loài địa y Usnea aciculifera thu hái ở Lâm Đồng, Việt Nam.

Thực nghiệm

Thiết bị và hóa chất 

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đo trên máy Bruker 400 (400 MHz cho phổ 1H-NMR và 100 MHz cho phổ 13C-NMR). Phổ khối lượng MS đo trên máy Bruker microOTOF Q-II và máy X500R QTOF. Sắc kí cột sử dụng silica gel 60 (0,040-0,063 mm, Merck), gel Sephadex LH-20 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden). Sắc kí lớp mỏng silica gel F254 (Merck). Các hóa chất dùng cho quá trình chiết và sắc kí là methanol (M), n-hexane (H), chloroform (C), ethyl acetate (EA), acetone (Ac) được cung cấp bởi hãng Chemsol.

Nguyên liệu
Địa y Usnea aciculifera được thu hái ở TP. Đà Lạt (1.2 kg) vào tháng 4/2018, tên khoa học của địa y được định danh bởi TS. Harrie Sipman, Đại học Freie University of Berlin, Đức. Mẫu tiêu bản thực vật (số hiệu SGU-006) được lưu trữ tại Phòng thí nghiệm Lý-Hóa-Sinh thuộc Khu liên phòng thí nghiệm, Đại học Sài Gòn. 

Chiết tách và phân lập

Địa y Usnea aciculifera được rửa sạch và phơi khô ở nhiệt độ phòng, được nghiền thành bột (1.0 kg) và ngâm trong n-hexane (8 × 5L), phần dịch lọc được thu hồi dưới áp suất thấp, thu được cao n-hexane (42,0 g). Cao n-hexane (UH) được tiến hành sắc kí cột silica gel pha thường, với hệ dung môi giải ly là H:EA (90:10 - 0:100, v/v), tiếp theo với hệ dung môi EA: M (90:10 - 0:100, v/v). Căn cứ vào kết quả sắc kí lớp mỏng, cao n-hexane của địa y được phân chia làm bảy phân đoạn (UH1 – UH7). 

Thực hiện sắc kí cột phân đoạn UH4 (8.6 g), giải ly với H:EA (85:15 - 0:100, v/v), thu được năm phân đoạn (UH4.1 - UH4.5). Phân đoạn UH4.3 (2.8 g) được sắc kí cột silica gel pha thường với hệ giải ly H:EA (80:20, v/v), sau đó sắc kí cột thực hiện sắc ký cột pha đảo với dung môi M-nước (6:4, v/v) thu được thu được hợp chất 1 (27.9 mg), hợp chất 2 (7.0 mg), hợp chất 3 (120.0 mg). 

Thực hiện sắc kí cột phân đoạn UH6 (7.3 g), giải ly với H:EA (80:20 - 0:100, v/v), thu được năm phân đoạn (UH6.1 - H6.5). Phân đoạn UH6.3 (1.4 g) được sắc kí cột silica gel pha thường với hệ giải ly H:EA (80:20, v/v), sau đó sắc kí cột gel Sephadex LH-20 với dung môi C:M (1:4, v/v) thu được hợp chất 4 (9.2 mg).

Hexadecanoic acid (hay palmitic acid) (2): dạng bột vô định hình màu trắng, tan trong chloroform. Khối phổ HR-ESI-MS m/z 257.2486 [M+H]+ (lý thuyết C16H33O2+ 257.2481).

Diffractaic acid (2): Dạng bột vô định hình màu nâu nhạt, tan trong acetone. 

Usnic acid (3): Dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt. Khối phổ ESI-MS m/z 343.19 [M-H]#, (tính toán lý thuyết C18H15O7# là 343,09).

Ergosterol-5á,8á-peroxide (4): dạng bột vô định hình màu trắng, tan tốt trong dung môi chloroform. Khối phổ HRESI-MS m/z 429.3385 [M+H]+ (lý thuyết C28H45O3+ 429.3369).

Dữ liệu phổ NMR của bốn hợp chất được trình bày trong Bảng 1 và Bảng 2.

Kết quả và thảo luận

Hợp chất 1

Phổ 1H-NMR của hợp chất 1 cho thấy các tín hiệu proton xuất hiện ở vùng từ trường cao trong đó đặc trưng với hai tín hiệu proton nhóm methylene tại dH [2.35 (t, 7.8 Hz, H-2) và 1.63 (m, H-3)], một tín hiệu proton nhóm methyl tại dH 0.88 (t, 7.2 Hz, H-16) và các tín hiệu proton của các nhóm methylene xuất hiện tại dH 1.28ppm.

Phổ 13C-NMR của hợp chất 1 cho thấy hầu hết các tín hiệu xuất hiện ở vùng từ trường cao, một tín hiệu carbon carboxylic acid tại dC 178.6 (C-1) giúp dự đoán hợp chất 1 là một hợp chất acid béo.

So sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất 1 với palmitic acid hay hexadecanoic acid[9] cho thấy có sự tương đồng, do đó đề nghị cấu trúc của hợp chất 1 là palmitic acid hay hexadecanoic acid.

Hợp chất 2

Phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất 2 có sự xuất hiện tín hiệu của 20 carbon bao gồm: Một carbon carboxylic acid tại dC 174.3 (C-7’), một carbon ester tại dC 166.4 (C-7); mười carbon tứ cấp tại dC [164.0 (C-2’), 160.8 (C-4), 157.8 (C-2), 154.4 (C- 4’), 140.9 (C-6’), 135.9 (C-6), 120.8 (C-1), 117.8 (C-3), 117.4 (C-1’), 110.2 (C-3’)]; hai carbon methine tại dC [117.0 (C-5’); 109.0 (C-5)]; hai carbon methoxy tại dC [62.2 (2- OCH3); 56.1 (4-OCH3)]; bốn carbon methyl tại dC [23.8 (C-9’), 19.9 (C-9), 9.2 (C-8’) và 9.0 (C-8)].

Phổ 1H-NMR cũng cho thấy có sự xuất hiện tín hiệu của hai proton vòng thơm tại dH [6.73 (1H, s, H-5) và 6.67 (3H, s, H-5’)] giúp đề nghị hợp chất 2 cũng có chứa cấu trúc của hai vòng thơm mang năm nhóm thế. Thêm vào đó phổ 1H-NMR cho thấy các tín hiệu của hai nhóm methoxy tại dH [3.88 (3H, s, 4-OCH3) và dH 3.84 (3H, s, 2- OCH3)]; bốn nhóm methyl tại dH [2.61 (3H, s, H-9’), 2.44 (3H, s, H-9), 2.14 (3H, s, H-8’), 2.13 (3H, s, H-8)].

So sánh dữ liệu phổ NMR của 2 với diffractaic acid[10] nhận thấy có sự tương đồng, nên đề nghị cấu trúc của hợp chất 2 là diffractaic acid.

Hợp chất 3

Phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất 3 có sự xuất hiện 18 tín hiệu carbon gồm ba carbon ketone tại dC [201.9 (C-14), 200.4 (C-17), 198.2 (C-1)]; chín carbon tứ cấp tại dC [191.9 (C-3), 179.5 (C-5), 164.1 (C-8), 157.7 (C-10), 155.4 (C-6), 109.5 (C-9), 105.4 (C-2), 104.1 (C-11), 101.7 (C-7)]; một carbon methine tại dC 98.5 (C-4); một carbon tứ cấp tại dC 53.9 (C-12); bốn carbon methyl tại dC [32.2 (C-13), 31.4 (C-18), 28.0 (C-15), 7.7 (C-16)].

Phổ 1H-NMR cũng cho thấy hợp chất 3 có sự xuất hiện tín hiệu các proton của một nhóm methine tại dH 5.97 (3H, s, H-4); bốn nhóm methyl tại dH [2.67 (3H, s, H-18), 2.66 (3H, s, H-15), 2.10 (3H, s, H-16), 1.76 (3H, s, H-13)]; hai nhóm hydroxy tại dH [13.30 (1H, s, 8-OH), 11.02 (1H, s, 10-OH)].

So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất 3 với dữ liệu của usnic acid trong tài liệu tham khảo[10] thấy có sự tương đồng, do đó đề nghị cấu trúc hợp chất 3 là usnic acid. 

Hợp chất 4

Phổ 1H-NMR của hợp chất 4 cho thấy sáu tín hiệu proton của sáu nhóm methyl tại dH [1.00 (3H, d, 5.5 Hz, H-21), 0.82 (3H, d, 6.0 Hz, H-26), 0.83 (3H, d, 5.5 Hz, H-27), 0.91 (3H, d, 9.0 Hz, H-28), 0.83 (3H, s, H-18), 0.88 (3H, s, H-19)]; một tín hiệu proton nhóm methine gắn với oxygen tại dH 3.98 (1H, m, H-3); bốn tín hiệu proton olefin tại dH [6.24 (1H, d, 8.4 Hz, H-6), 6.50 (1H, d, 8.4 Hz, H-7), 5.22 (1H, dd, 15.0, 7.2 Hz, H-22), 5.15 (1H, dd, 15.6, 8.4 Hz, H-23)]; hai mươi tín hiệu proton cộng hưởng tại dH từ 1.23-2.10.

Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ HSQC của hợp chất 4 cho thấy tín hiệu cộng hưởng của 28 carbon bao gồm bốn tín hiệu carbon olefin cộng hưởng tại dC [135.4 (C-6), 135.2 (C-22), 132.3 (C-23), 130.8 (C-7)]; ba tín hiệu carbon gắn với oxygen tại dC [82.2 (C-5), 79.4 (C-8), 66.5 (C-3)]; sáu tín hiệu carbon nhóm methyl cộng hưởng tại dC [23.4 (C-21), 20.0 (C-27), 19.7 (C-26), 18.2 (C-18), 17.6 (C-28), 12.9 (C-19)]. 

Phổ COSY của hợp chất 4 cho thấy các tương quan giữa H-3 với H-2 và H-4 giúp hỗ trợ xác định nhóm hydroxy (–OH) liên kết với C-3; tương quan giữa H-6 và H-7; các tương quan giữa H-20 với H-21 và H-22; H-22 với H-23; H-23 với H-24 giúp hỗ trợ xác định các proton này gắn trên các carbon liền kề nhau.

Phổ HMBC của hợp chất 4 cho thấy các tương quan giữa proton H-6 và H-7 với C-5 và C-8 giúp xác định cấu trúc của vòng B; thêm vào đó tương quan giữa proton H-21 với C-17, C-20, C-22; tương quan giữa proton H-22 với C-20, C-24, C-21; tương quan của H-23 với C-20, C-24, C-26 giúp đề nghị dây nhánh gắn vào C-17.

So sánh dữ liệu phổ của hợp chất 4 với ergosterol-5á,8á-peroxide[11] cho thấy có sự tương đồng, do đó đề nghị cấu trúc của hợp chất 4 là ergosterol-5á,8á-peroxide.

Hình 1: Cấu trúc hóa học của các hợp chất 1 - 4 

Kết luận

Bốn hợp chất Hexadecanoic acid (1), Diffractaic acid (2), Usnic acid (3) và Ergosterol-5á,8á-peroxide (4) lần đầu được phân lập từ loài địa y Usnea aciculifera. Cấu trúc của các hợp chất này được xác định dựa vào dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR, khối phổ MS và so sánh với tài liệu tham khảo. Với thành phần hóa học đa dạng, địa y là một đối tượng nghiên cứu hấp dẫn cần được tiếp tục khảo sát trong tương lai. 

Tài liệu tham khảo

1.    Stuart D. Crawford, Lichen Secondary Metabolites: Bioactive Properties and Pharmaceutical Potential. Springer (Switzerland), 2015;

2.    Yoshihito Ohmura, A Synopsis of the Lichen genus Usnea (Parmeliaceae, Ascomycota) in Taiwan, Mem. Natl. Mus. Nat. Sci., 2012, (48), 91137, March 28;

3.    K.S.Vinayaka, S.Nayaka, Y.L.Krishnamurthy, D.K.Upteri, A report on some macrolichens new to Karnataka, India, Journal of Threatened Taxa, 2012, 4(1), 2318–2321;

4.     Karunaratne V. , “Lichen substances: Biochemistry, ecological role and economic uses”, Ceylon Journal of Science: Physical Sciences, 1999, 6(1), 13-28;

5.    Thell A, Crespo A, Divakar PK et al, A review of the lichen family Parmeliaceae history, phylogeny and current taxonomy, Nord J. Bot. 2012, 30. 641-664;

6.    Ari, F., Parmelia sulcata Taylor and Usnea filipendula Stirt induce apoptosis like cell death and DNA damage in cancer cells, Cell proliferation, 2014, 47(5), 457-464;

7.    Luo, H., Lecanoric acid, a secondary lichen substance with antioxidant properties from Umbilicaria antarctica in maritime Antarctica (King George Island), Polar Biology, 2009, 32(7), 1033-1040;

8.    Guo, L., Review of usnic acid and Usnea barbata toxicity, Journal of Environmental Science and Health, Part C, 2008, 26(4), 317-338;

9.     Neoh Bee Keat, R. U. Umar, N. H. Lajis. Chemical constituents from two weed species of Spermacoce (Rubiaceae), The Malaysia Journal of Analytical Sciences, 2010, 14 (1), 6-11;

10. Luiz Fabrício Gardini Brandão et al., “Cytotoxic evaluation of phenolic compounds from lichens against melanoma cells”, Chem. Pharm. Bull, 2013, 61(2) 176-183;

11. Nguyen Thi My Dung, Pham Nguyen Kim Tuyen, Jacques Mortier, Nguyen Kim Phi Phung, Some triterpenoids and steroids from the lichen Lobaria orientalis, Lobariaceae. Journal of Science and Technology, 2016, 54 (2C), 313-319.

TRẦN HỒNG NGỌC QUYÊN, NGUYỄN HUY HOÀNG PHI, ĐỖ THỊ MỸ LIÊN*
Trường Đại học Sài Gòn, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam
Nguồn: Tạp chí Tài nguyên và Môi trường số 4 năm 2024