Nghiên cứu này được tiến hành nhằm tìm ra chất mang để tồn trữ vi khuẩn Bacillus subtilis, làm cơ sở cho các nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học ứng dụng trong phòng bệnh hoại tử gan tuỵ cấp trên tôm do vi khuẩn Vibrio parahemolyticus gây ra gây ra. Bốn loại chất mang: Hỗn hợp chất mang (HHCM) gồm: Dextroza, Lactoza, Tinh bột tan, MOS (manan oligosacarit), FOS (Fructo-oligosacarit), Phytaza, Proteaza, Amylaza, Natri glutamat; cao lanh; cám gạo và than bùn được khảo sát, khả năng tồn trữ Bacillus subtilis dựa vào hai tiêu chí là mật độ, khả năng đối kháng với Vibrio parahemolyticus. Kết quả cho thấy, sau 06 tháng tồn trữ, mật độ vi khuẩn trong chất mang là HHCM đạt hơn 107 CFU/g, trong chất mang là cám gạo và than bùn đạt hơn 105 CFU/g. Vi khuẩn Bacillus subtilis trong ba loại chất mang này duy trì tốt khả năng đối kháng với vi khuẩn Vibrio parahemolyticus.
Mở đầu
Ngành nuôi tôm ở Việt Nam hiện nay có một số thách thức lớn như phần lớn hạ tầng vùng nuôi chưa đảm bảo, mặc dù diện tích lớn nhưng sản lượng và giá trị thấp. Bên cạnh đó, chất dinh dưỡng của môi trường bao gồm thức ăn thừa và chất thải phân tôm có thể gây phú dưỡng ảnh hưởng đến môi trường, dẫn đến suy giảm nồng độ oxy hòa tan trong nước, sự phân hủy chất hữu cơ có thể tạo ra ammoniac và nitrit, NH3 và NO2- gây độc cho tôm. Ngoài ra, theo Cục Thú Y thống kê từ đầu năm 2023, cả nước có trên 1.612 ha tôm nuôi tại 6 tỉnh bị thiệt hại, trong đó 688 ha bị thiệt hại do dịch bệnh. Trong các bệnh gây hại chính trên tôm nuôi thì bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) xảy ra ngày càng trầm trọng hơn. Hiện nay, Việt Nam đang tiến đến ngưng sử dụng kháng sinh trị bệnh trên tôm, chuyển sang giải pháp sử dụng chế phẩm vi sinh. Nghiên cứu này được thực hiện dựa trên lợi khuẩn Bacillus subtilis được sử dụng để sản xuất chế phẩm vi sinh, Bacillus subtilis được phân lập từ nước ao nuôi tôm, có khả năng cải thiện môi trường nước và đối kháng tốt với vi khuẩn gây bệnh AHPND. Bacillus subtilis trong chế phẩm thương mại đòi hỏi phải duy trì được mật độ đối kháng cao trong thời gian dài. Các chế phẩm sinh học có thể duy trì được mật độ và có thể kiểm soát sinh học hay không phụ thuộc rất lớn vào các thành phần có trong chế phẩm, đặc biệt là là chất mang. Chất mang phải đảm bảo sự tăng trưởng và duy trì mật độ mong muốn của các chủng vi sinh vật trong khoảng thời gian chấp nhận được (Smith, 1992).
Vật liệu và phương pháp
Vật liệu nghiên cứu: Vi khuẩn Bacillus subtilis đã được phân lập Cần Giờ, TP. Hồ Chí Minh, trong bộ sưu tập vi khuẩn đối kháng tại Trường Đại học TN&MT TP. Hồ Chí Minh.
Các loại chất mang được tuyển chọn gồm có: Hỗn hợp chất mang (HHCM) gồm: Dextroza (50), Lactoza (30), Tinh bột tan (17.5), MOS (manan oligosacarit) (0.5), FOS (Fructo-oligosacarit) (0.5), Phytaza (0.3), Proteaza (0.5), Amylaza (0.5), Natri glutamat (0.2); Cao lanh: Al2O3.2SiO2.2H2O, Al2O3: 39,48%, SiO2: 46,6%, H2O: 13,92%, tỷ trọng: 2,57 - 2,61; Cám gạo: OC: 28%; Protein 12%, lipit: 4%; Than bùn: OC: 12%; pH: 4,5; Axit humix: 3%.
Phương pháp nghiên cứu
Quá trình nhân giống: Nhân giống và nuôi cấy thu sinh khối các chủng vi khuẩn Bacillus bằng môi trường NB cải tiến (Nutrient Broth) có thành phần dưới đây: Pepton (5.0g), Cao thịt (Meat Extract) (3.0g), MgSO4(0.2g), NaCl (10-30g), H2O (1000mL), pH=7-7.2, hấp 1210C trong 30 phút. Chủng vi khuẩn sau khi nhân giống cấp 2 được bổ sung 10% giống vào thiết bị lên men có môi trường phù hợp; Nhiệt độ nuôi cấy thu sinh khối 28-320C (nhiệt độ phòng); Tốc độ khuấy 150 vòng/phút; Sau 32- 36 giờ nuôi, dịch nuôi đạt mật độ tế bào cao nhất khoảng 109 /mL, có thể thu sinh khối bằng cách ly tâm. Mật độ vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo OD ở bước sóng 600 nm. Mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis trong nghiên cứu ≥ 108 CFU/mL.
Xác định tỷ lệ phối trộn dịch sinh khối Bacillus subtilis và chất mang: Phối trộn dịch sinh khối tươi vào chất mang theo tỷ lệ 5/50, 10/50, 15/50, 20/50. Tỷ lệ phối trộn phù hợp khi mật độ tế bào vi sinh vật là cao nhất và hoạt tính sinh học của vi sinh vật ổn định trong các thời điểm kiểm tra 0 giờ và sau 30 giờ (Bùi Huy Hiền và cộng sự, 2011). Sản phẩm sau phối trộn theo tỷ lệ cho kết quả tối ưu được sấy nhẹ ở nhiệt độ 400C trong thời gian 3 - 4 giờ, sau đó được đóng gói trong các túi nilong tối màu, bảo quản nhiệt độ phòng.
Bảng 1. Khả năng tồn tại của Bacillus subtilis trên nền các chất mang
.jpg)
Khảo sát mật số của vi khuẩn Bacillus subtilis trong chất mang theo thời gian: Thí nghiệm được thực hiện 1 lần/tháng, tiến hành và quan sát trong 6 tháng. Cân 1g mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 mL nước cất đã khử trùng và vortex để đồng nhất mẫu (mẫu ở độ pha loãng 101). Mẫu được tiếp tục pha loãng thành các độ pha loãng 102, 103 ,104, 105, 106. Hút 50 µl huyền phù vi khuẩn đã được pha loãng về nồng độ thích hợp vào đĩa môi trường nutrient agar và trải đều lên bề mặt môi trường bằng que tam giác, sau đó ủ đĩa ở 30oC; sau 48 giờ, đếm số khuẩn lạc được hình thành.
Bảng 2: Mật độ của vi khuẩn Bacillus subtilis trong 4 loại chất mang khác nhau (HHCM, cao lanh; cám gạo và than bùn) trong 6 tháng tồn trữ
.jpg)
Khảo sát khả năng đối kháng trên đĩa thạch của vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian tồn trữ: Chuẩn bị đĩa thạch MHA, 2,5% agar. Trải 100µl dịch lên men chủng Vibrio parahaemolyticus pha loãng có độ hấp thụ phải nằm trong tiêu chuẩn McFarland 0,5 (giá trị OD 0,08 - 0,12 tại bước sóng 625 nm, tương đương khoảng 1 - 2 × 108 CFU/ml). Đục lỗ thạch có đường kính 6 mm, bơm 40 µL dịch Bacillus subtilis. Đem ủ ở nhiệt độ phòng, 24 giờ. Đo đường kính vòng kháng khuẩn. Mỗi loại hỗn hợp với chất mang khác nhau được lặp lại 3 lần trên cùng 1 đĩa
Bảng 3: Bán kính vòng vô khuẩn (mm) do vi khuẩn Bacillus subtilis tồn trữ trong chất mang tạo ra khi đối kháng với Vibrio parahemolyticus
.jpg)
Tiêu chuẩn để khảo sát khả năng đối kháng dựa vào bán kính vòng vô khuẩn
Vi khuẩn đối kháng yếu có bán kính từ 1 đến 4 mm, vi khuẩn đối kháng trung bình có bán kính từ 5 đến 8 mm, vi khuẩn đối kháng mạnh có bán kính từ 9 đến 12 mm, vi khuẩn đối kháng rất mạnh có bán kính từ 12 mm trở lên (Ahmed and Zahran, 2006). Quan sát khả năng tạo vòng vô khuẩn của vi khuẩn đối kháng và đo bán kính vòng vô khuẩn sau 48 giờ. Bán kính vòng vô khuẩn được đo ở mặt sau đĩa petri từ điểm ngoài cùng của bìa khuẩn lạc đến điểm lan cuối cùng của vòng vô khuẩn. Số liệu bán kính vòng vô khuẩn là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại.
Kết quả và thảo luận
Kết quả nghiên cứu tỷ lệ phối trộn dịch sinh khối Bacillus subtilis và chất mang
Kết quả cho thấy, với tỷ lệ phối trộn dịch sinh khối với mỗi chất mang là 5/50 thì mật độ Bacillus subtilis tại thời điểm 0 giờ đạt 107 CFU/g, sau 30 ngày mật độ Bacillus subtilis trên nền các chất mang không có sự thay đổi và vẫn duy trì ở khoảng 107 CFU/g, như vậy sẽ không đảm bảo chất lượng theo TCVN. Trong khi đó, tỷ lệ phối trộn dịch sinh khối Bacillus subtilis với chất mang là 10/50, 15/50, 20/50 thì sau 30 ngày mật độ Bacillus subtilis duy trì mật độ trên 108 CFU/g. Tỷ lệ phối trộn dịch sinh khối/chất mang là 10/50 là phù hợp, được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả khảo sát mật độ của vi khuẩn Bacillus subtilis trong chất mang sau mỗi tháng tồn trữ
Bảng 2 cho thấy, thời điểm ngay sau khi đóng gói, mật số vi khuẩn Bacillus subtilis ở các nghiệm thức chất mang khác biệt không ý nghĩa về mặt thống kê, mật độ đạt 3,5 - 3,9 x 108 CFU/g. Một tháng sau thời gian tồn trữ, mật độ vi khuẩn ở nghiệm thức HHCM cao nhất 5,1 x 108 CFU/g khác biệt so với các nghiệm thức chất mang còn lại. Thời điểm sau 2 tháng, mật độ vi khuẩn của nghiệm thức cao lanh là 2,6 x 106 CFU/g, giảm nhanh so với các nghiệm thức chất mang còn lại. Thời điểm sau 3 tháng, mật độ vi khuẩn trong chất mang HHCM duy trì ở mức cao (4,2x108 CFU/g). Riêng nghiệm thức cao lanh, mật độ vi khuẩn vẫn giảm mạnh và thấp (1,2 x 103 CFU/g) nên không được khảo sát ở tháng 4. Tại thời điểm tháng 5 và tháng 6 chỉ khảo sát nghiệm thức HHCM, cám gạo và than bùn do nghiệm thức cao lanh mật độ đã giảm mạnh. Hai thời điểm này, nghiệm thức HHCM duy trì được mật số tốt nhất (4,1 x 107 CFU/g chế phẩm) kế đến là nghiệm thức than bùn (2,1 x 105 CFU/g) và cám gạo (1,5 x 105 CFU/g) Tóm lại, nghiệm thức HHCM duy trì được mật độ vi khuẩn tốt nhất (>107 CFU/g) sau 6 tháng tồn trữ và khác biệt với các nghiệm thức chất mang còn lại. Đối với các nghiệm thức cám gạo và than bùn có mật độ >107 CFU/g sau 4 tháng và giảm dần đến tháng 6 mật độ còn >105 CFU/g.
Kết quả phân tích cho thấy, mật độ Bacillus subtilis ở tất cả các nghiệm thức chất mang giảm vào tháng thứ nhất và tiếp tục giảm dần qua mỗi tháng tồn trữ. Điều này cũng phù hợp theo kết quả nghiên cứu của Omer (2010), các chất mang dạng trơ dùng để tồn trữ các vi khuẩn hình thành nội bào tử như Bacillus sp. đều có mật số giảm dần theo thời gian. Trong đó, mật số vi khuẩn giảm mạnh trong tháng đầu do chưa thích nghi với môi trường mới và chưa đủ thời gian hình thành nội bào tử.
Kết quả khảo sát khả năng đối kháng trên đĩa thạch của vi khuẩn Bacillus subtilis trong chất mang sau mỗi tháng tồn trữ
Chất mang cao lanh không duy trì được mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis tốt nên không được khảo sát mật độ vi khuẩn trong chất mang kể từ tháng thứ 4, cũng như không khảo sát khả năng đối kháng trên đĩa thạch đối với vi khuẩn Vibrio parahemolyticus đói với nghiệm thức chất mang này. Kết quả khảo sát tính đối kháng của vi khuẩn Bacillus subtilis trong chất mang HHCM, cao lanh, cám gạo, than bùn trình bày ở Bảng 3 cho thấy bán kính vòng vô khuẩn của vi khuẩn Bacillus subtilis qua 3 tháng có sự khác biệt nhưng dao động không lớn (khoảng 7-14 mm). Trong đó, ở nghiệm thức chất mang HHCM, vi khuẩn vẫn còn khả năng đối kháng mạnh (>11 mm) đến tháng thứ 6. Nhìn chung, Bacillus subtilis trong tất cả nghiệm thức chất mang vẫn còn khả năng đối kháng mạnh sau 6 tháng tồn trữ.
Kết luận: Kết quả nghiên cứu cho thấy được tỷ lệ phối trộn dịch sinh khối Bacillus subtilis và chất mang phù hợp là 10/50 và khả năng tồn trữ của Bacillus subtilis trong 4 loại chất mang: HHCM gồm Dextroza, Lactoza, Tinh bột tan, MOS (manan oligosacarit), FOS (Fructo-oligosacarit), Phytaza, Proteaza, Amylaza, Natri glutamat; cao lanh; cám gạo và than bùn. Sau 6 tháng tồn trữ, nghiệm thức HHCM duy trì mật độ vi khuẩn >107 CFU/g, nghiệm thức cám gạo và than bùn duy trì được mật độ trên 105 CFU/g. Vi khuẩn tồn trữ trong 3 loại chất mang vẫn còn khả năng đối kháng với Vibrio parahemolyticus trên đĩa thạch và vi khuẩn trên chất mang HHCM là có sự đối kháng tốt nhất. Tính ổn định của Bacillus subtilis trong chất mang theo thời gian sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc sản xuất chế phẩm vi sinh với mục đích thương mại hóa.
Lời cảm ơn: Công trình này hoàn thành với sự hỗ trợ về kinh phí từ đề tài cấp Sở KH&CN TP. Hồ Chí Minh: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm Zeolite sinh học nhằm cải thiện môi trường nước, phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm”. CNĐT. ThS Lê Thị Phụng.
Tài liệu tham khảo
1. Ahmed, N.A., Zahran, E.B., 2006. Inhibition of soil borne Xanthomonas campestris pv. Malvacearum in cotton by Bacillus spp. Mitt. Biol. Bundesanst. Land - Forstwirtsch. 408: 86-92;
2. Bùi Huy Hiền và cộng sự, Báo cáo tổng kết nghiệm thu đề tài “Nghiên cứu chế phẩm VSV xử lý nhanh phế thải chăn nuôi”, Thuộc chương trình Công nghệ Sinh học - Bộ NN& PTNT (2011);
3. Joshi, J., J. Srisala, V.H. Truong, I.T. Chen, B. Nuangsaeng, O. Suthienkul, C.F. Lo, T.W. Flegel, K. Sritunyalucksana, and S. Thitamadee. 2014. Variation 53 in Vibrio Parahaemolyticus isolates from a single Thai shrimp farm experiencing an outbreak of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND). Aquaculture, 428 - 429: 297-302;
4. Omer, A.M., 2010. Bioformulations of Bacillus Spores for using as Biofertilizer. Life science journal. 7(4): 124-131.
LÊ THỊ PHỤNG
Trường Đại học Tài nguyên và Môi trường TP. Hồ Chí Minh
Nguồn: Tạp chí Tài nguyên và Môi trường số 4 năm 2024
Tóm tắt: Bài báo nghiên cứu giải pháp xử lý chất thải rắn sinh hoạt (CTRSH) bền vững cho Việt Nam thông qua tích hợp công nghệ vi sinh (phân hủy sinh học) và nhiệt phân. Trước áp lực gia tăng rác đô thị và yêu cầu phát triển kinh tế tuần hoàn, phương pháp này được đề xuất nhằm tận dụng tài nguyên từ rác, giảm chôn lấp và phát thải.
Nếu ở Kỳ 1, độc giả đã thấy những định hướng chiến lược và công nghệ xanh mở ra lối đi mới cho nông nghiệp Việt, thì đến Kỳ 2, điểm nhấn lại nằm ở những giải pháp cụ thể. Từ phòng thí nghiệm, nhiều nghiên cứu khoa học đã bước ra thực tiễn, đồng hành cùng doanh nghiệp, tạo nên các mô hình thành công: từ công nghệ bảo quản mới, chế biến cà phê hiện đại, đến kinh tế tuần hoàn phụ phẩm tôm và nâng tầm sản phẩm truyền thống như nước mắm. Đây chính là những hạt nhân giúp nông sản Việt gia tăng giá trị và chinh phục thị trường quốc tế.
Cao chloroform của Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum Jack.) được sắc ký cột với các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau và kết hợp với kỹ thuật sắc ký lớp mỏng để thực hiện quá trình phân lập và tinh sạch các hợp chất. Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân và kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo. Ba hợp chất được tinh sạch và xác định cấu trúc bao gồm luteolin (1), quercetin (2) và quercitrin (3).
Hoạt tính xua đuổi hiệu quả của p-menthan-3,8-diol (PMD) đã được chứng minh là hiệu quả an toàn cho sức khỏe, tuy nhiên, hợp chất này vẫn chưa được sử dụng phổ biến ở Việt Nam. Đã có một số công trình nghiên cứu khảo sát tổng hợp PMD chủ yếu sử dụng xúc tác acid H2SO4 loãng với các điều kiện phản ứng khác nhau về thời gian và nhiệt độ.
Cháy nổ trong sinh hoạt dân dụng vẫn là một vấn đề nhức nhối tại Việt Nam, gây ra những thiệt hại nặng nề về người và tài sản do sự bất cẩn hoặc lỗi thiết bị điện. Các hệ thống cảnh báo cháy truyền thống thường có độ trễ cao, chỉ phản ứng khi cháy đã xảy ra rõ ràng, dễ gây báo động giả và thiếu khả năng cảnh báo từ xa.
Khu vực đảo Palawan (Philippine), Sempoma SABAH (Malaysia) nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa với hai mùa mưa, mùa khô rõ rệt. Tại Palawan, trung bình năm nhiệt độ không khí 28,50C, độ ẩm trung bình 58,4%, tổng lượng mưa 2.920 mm, tổng số giờ nắng trong khoảng 2,180 - 2,307h, nhiệt độ nước biển 29,30C và độ muối nước biển 33,3‰.
